بخش ۱: مقدمه: آخرین مرز در درمان HIV

۱.۱ پیروزی و بن‌بست درمان ضدرتروویروسی (ART)

ظهور درمان ترکیبی ضدرتروویروسی (cART یا ART) در اواسط دهه ۱۹۹۰، چشم‌انداز عفونت ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) را به طور کامل دگرگون کرد. این رویکرد درمانی، که شامل ترکیبی از داروها برای هدف قرار دادن مراحل مختلف چرخه حیات ویروس است، HIV را از یک بیماری کشنده به یک وضعیت مزمن قابل کنترل تبدیل کرده است. ART با سرکوب مؤثر تکثیر ویروس تا سطوح غیرقابل شناسایی در خون، به افراد مبتلا به HIV اجازه می‌دهد تا زندگی طولانی و سالمی داشته باشند. با این حال، این پیروزی درمانی با یک محدودیت اساسی همراه است: ART یک درمان مادام‌العمر است، نه یک علاج قطعی. این داروها نمی‌توانند ویروس را به طور کامل از بدن ریشه‌کن کنند و قطع درمان به طور حتم منجر به بازگشت سریع ویروس (viral rebound) می‌شود. این واقعیت، هسته اصلی چالشی را تشکیل می‌دهد که این گزارش به آن می‌پردازد: نیاز به یک استراتژی درمانی که بتواند ویروس را برای همیشه از بدن حذف کند.

۱.۲ دژ پایداری: مخزن نهفته HIV

محدودیت اصلی ART ریشه در یک پدیده بیولوژیکی پیچیده دارد: تشکیل مخازن نهفته HIV. این مخازن مجموعه‌ای از سلول‌های آلوده با عمر طولانی، عمدتاً سلول‌های T +CD4 در حال استراحت، هستند که یک نسخه خاموش و یکپارچه از ژنوم HIV (معروف به پروویروس) را در خود جای داده‌اند. این سلول‌ها از دید سیستم ایمنی پنهان هستند و تحت تأثیر ART قرار نمی‌گیرند، زیرا این داروها فقط ویروسی را هدف قرار می‌دهند که به طور فعال در حال تکثیر است. در حالت نهفتگی، پروویروس به صورت رونویسی خاموش است و هیچ پروتئین ویروسی تولید نمی‌کند، بنابراین هیچ هدفی برای حمله سیستم ایمنی یا داروها وجود ندارد. پایداری این مخزن، بزرگترین مانع برای دستیابی به درمان قطعی HIV است، زیرا هر زمان که درمان متوقف شود، این سلول‌ها می‌توانند دوباره فعال شده و تولید ویروس را از سر بگیرند.

۱.۳ یک تغییر پارادایم در پزشکی: ویرایش ژن به عنوان یک روش درمانی قطعی

در مواجهه با چالش مخزن نهفته، یک تغییر پارادایم در حال ظهور است که از استراتژی‌های سرکوب ویروس فراتر می‌رود. فناوری‌های ویرایش ژن، به ویژه سیستم CRISPR-Cas9، رویکردی اساساً متفاوت را ارائه می‌دهند: یک «چاقوی جراحی مولکولی» که پتانسیل هدف‌گیری مستقیم و حذف دائمی DNA پروویروسی از ژنوم سلول میزبان را دارد. این فناوری، که از یک سیستم دفاعی طبیعی در باکتری‌ها الهام گرفته شده، به دانشمندان اجازه می‌دهد تا با دقت بی‌سابقه‌ای توالی‌های خاص DNA را برش داده و تغییر دهند. این قابلیت، مسیر جدیدی را برای درمان قطعی (sterilizing cure) یا عملکردی (functional cure) HIV باز می‌کند و امید به ریشه‌کن کردن کامل ویروس از بدن را زنده می‌کند.

تلاش برای درمان HIV با استفاده از ویرایش ژن، صرفاً یک چالش ویروس‌شناسی نیست، بلکه یک تلاش پیشگامانه در حوزه گسترده‌تر پزشکی ژنومی است. موانعی که در مسیر توسعه یک درمان مبتنی بر CRISPR برای HIV وجود دارد – مانند چالش‌های مربوط به تحویل (delivery)، ایمنی و کارایی – منحصر به HIV نیستند، بلکه نمایانگر چالش‌های اصلی ویرایش ژن in vivo برای بسیاری از بیماری‌های انسانی دیگر نیز می‌باشند. این چالش‌ها در زمینه بیماری‌های ژنتیکی مانند بیماری سلول داسی‌شکل یا دیستروفی عضلانی نیز مطرح هستند. بنابراین، حل این مشکلات برای HIV می‌تواند یک نقشه راه فناورانه و نظارتی ایجاد کند که برای طیف وسیعی از بیماری‌های ژنتیکی و عفونی دیگر قابل استفاده باشد. این بدان معناست که موفقیت در این زمینه، فراتر از درمان یک بیماری، می‌تواند کل حوزه ویرایش ژن درمانی را به پیش براند و عصر جدیدی را در پزشکی مولکولی آغاز کند.

بخش ۲: نشان پاک‌نشدنی HIV: یکپارچگی پروویروسی و نهفتگی

۲.۱ دکترین رتروویروسی: از RNA تا DNA پروویروسی

برای درک اینکه چرا حذف HIV بسیار دشوار است، باید به مکانیسم منحصربه‌فرد تکثیر آن به عنوان یک رتروویروس پرداخت. پس از ورود به سلول میزبان، HIV از آنزیم ویروسی خود به نام «ترانس‌کریپتاز معکوس» برای تبدیل ژنوم RNA تک‌رشته‌ای خود به یک نسخه DNA دورشته‌ای خطی استفاده می‌کند. این فرآیند به شدت مستعد خطا است که به تنوع ژنتیکی بالای HIV و توانایی آن در فرار از سیستم ایمنی و داروها کمک می‌کند. DNA ویروسی تازه سنتز شده، به همراه پروتئین‌های ویروسی (مانند اینتگراز) و پروتئین‌های میزبان، یک کمپلکس نوکلئوپروتئینی به نام «کمپلکس پیش-یکپارچگی» (PIC) را در سیتوپلاسم تشکیل می‌دهد. این کمپلکس برای مرحله بعدی و حیاتی چرخه حیات ویروس آماده می‌شود: یکپارچگی با ژنوم میزبان.

۲.۲ نقطه بی‌بازگشت: مکانیسم یکپارچگی ویروسی

یکپارچگی، رویدادی است که عفونت HIV را به یک وضعیت دائمی تبدیل می‌کند. این فرآیند توسط آنزیم ویروسی «اینتگراز» (IN) کاتالیز می‌شود و شامل شش مرحله متوالی است:

1. اتصال اینتگراز به DNAی HIV: در سیتوپلاسم، اینتگراز به دو انتهای DNA ویروسی در نواحی خاصی به نام «تکرارهای بلند انتهایی» (LTRs) متصل می‌شود.
2. پردازش انتهای ‘۳ DNAی HIV: اینتگراز دو نوکلئوتید را از هر انتهای ‘۳ DNA ویروسی جدا می‌کند و انتهای چسبنده‌ای ایجاد می‌کند که برای حمله به DNA میزبان آماده است.
3. انتقال به هسته: کمپلکس پیش-یکپارچگی به داخل هسته سلول میزبان منتقل می‌شود.
4. اتصال به DNA میزبان: در داخل هسته، اینتگراز با کمک فاکتورهای میزبان به DNA کروموزومی میزبان متصل می‌شود.
5. انتقال رشته (Strand Transfer): اینتگراز پیوندهای فسفودی‌استر را در DNA میزبان می‌شکند و انتهای ‘۳ پردازش‌شده DNA ویروسی را به طور کووالانسی به DNA میزبان متصل می‌کند.
6. ترمیم شکاف (Gap Repair): ماشین‌آلات ترمیم DNA سلول میزبان، شکاف‌های باقی‌مانده در محل اتصال را پر کرده و فرآیند یکپارچگی را تکمیل می‌کنند. در این مرحله، DNA ویروسی به طور دائمی به بخشی از ژنوم سلول میزبان تبدیل می‌شود و «پروویروس» نام می‌گیرد.

این فرآیند یکپارچگی تصادفی نیست. HIV ترجیح می‌دهد ژنوم خود را در ژن‌های فعال و به شدت رونویسی‌شده ادغام کند. این انتخاب محل توسط فاکتورهای میزبان، به ویژه پروتئینی به نام LEDGF/p75، هدایت می‌شود که ماشین یکپارچگی ویروس را به کروماتین میزبان متصل می‌کند. این تمایل به یکپارچگی در ژن‌های فعال، یک شمشیر دولبه است: از یک سو، بیان کارآمد ژن‌های ویروسی را پس از فعال‌سازی مجدد تسهیل می‌کند، و از سوی دیگر، به پایداری حالت نهفته در سلول‌های با عمر طولانی کمک می‌کند، زیرا این سلول‌ها اغلب از نظر متابولیکی فعال هستند.

یکپارچگی غیرتصادفی HIV در «نقاط داغ» خاصی از ژنوم انسان، مانند ژن‌هایی که رشد سلولی را تنظیم می‌کنند (مانند MKL2 و BACH2)، پیامدهای عمیقی هم برای پایداری ویروس و هم برای ایمنی درمان‌های مبتنی بر CRISPR دارد. شواهد نشان می‌دهد که سلول‌های آلوده‌ای که به صورت کلونال تکثیر می‌شوند (یعنی از یک سلول والد منشأ می‌گیرند) و بخش مهمی از مخزن پایدار را تشکیل می‌دهند، اغلب پروویروس‌هایی دارند که در این ژن‌های مرتبط با سرطان یکپارچه شده‌اند. این مشاهدات حاکی از آن است که خود فرآیند یکپارچگی ممکن است یک مزیت بقا یا تکثیر به سلول میزبان اعطا کند و در نتیجه ویروس به طور مؤثری پایداری خود را در سطح سلولی هدایت می‌کند. هنگام طراحی یک درمان CRISPR، این بدان معناست که «هدف» فقط یک سلول آلوده معمولی نیست، بلکه جمعیتی از سلول‌ها با خواص رشد تغییر یافته است. علاوه بر این، همانطور که مطالعات هشدار می‌دهند، شکست‌های DNA ناشی از CRISPR در نزدیکی این مکان‌های یکپارچگی می‌تواند باعث جهش‌های ناخواسته در DNA میزبان اطراف شود. بنابراین، هدف قرار دادن یک پروویروس واقع در یک ژن حیاتی تنظیم‌کننده رشد، خطر بیشتری را به همراه دارد. یک اثر خارج از هدف (off-target) یا یک خطا در ترمیم DNA در این مکان خاص می‌تواند پیامدهای انکوژنیک داشته باشد، که خطری بسیار بزرگتر از یک خطا در یک منطقه غیر ژنی است. این موضوع نگرانی ایمنی را از یک خطر کلی به یک خطر خاص و وابسته به زمینه که با بیولوژی بنیادی پایداری HIV مرتبط است، ارتقا می‌دهد.

۲.۳ برقراری سکوت: اساس مولکولی نهفتگی

پس از یکپارچگی، پروویروس می‌تواند به حالت رونویسی خاموش درآید و نهفتگی را برقرار کند. چندین مکانیسم در این فرآیند نقش دارند. محیط کروماتینی موضعی در محل یکپارچگی بسیار مهم است؛ اگر پروویروس در یک ناحیه هتروکروماتین (کروماتین فشرده و غیرفعال) ادغام شود، احتمال خاموش شدن آن بیشتر است. علاوه بر این، تغییرات اپی‌ژنتیکی مانند دِاستیلاسیون هیستون‌ها می‌تواند ساختار کروماتین را فشرده کرده و دسترسی فاکتورهای رونویسی را به پروموتر ویروسی مسدود کند. در نهایت، در سلول‌های T در حال استراحت، سطح فاکتورهای رونویسی سلولی کلیدی (مانند NF-κB) و فعال‌کننده رونویسی ویروسی (Tat) پایین است که برای شروع بیان ژن ویروسی ضروری هستند. این سکوت مولکولی، مخزن نهفته را از دید سیستم ایمنی و درمان‌های ضدرتروویروسی پنهان نگه می‌دارد.

بخش ۳: CRISPR-Cas9: یک نوکلئاز قابل برنامه‌ریزی برای بازنویسی ژنوم

۳.۱ یک سیستم ایمنی باکتریایی بازطراحی‌شده

فناوری CRISPR-Cas9 از یک سیستم دفاعی طبیعی که در باکتری‌ها و آرکی‌ها برای مقابله با ویروس‌های مهاجم (فاژها) تکامل یافته، اقتباس شده است. باکتری‌ها قطعات کوچکی از DNA ویروس‌های مهاجم را در ناحیه‌ای از ژنوم خود به نام لوکوس CRISPR ذخیره می‌کنند. این توالی‌های ذخیره‌شده به عنوان یک «حافظه مولکولی» عمل می‌کنند. در صورت عفونت مجدد، این توالی‌ها به مولکول‌های RNA راهنما رونویسی می‌شوند که پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas) را به سمت DNA ویروس مهاجم هدایت کرده و آن را برش داده و غیرفعال می‌کنند. دانشمندان این سیستم طبیعی را برای ایجاد یک ابزار ویرایش ژن قدرتمند و قابل برنامه‌ریزی مهندسی کرده‌اند.

۳.۲ مکانیسم عمل: عملکرد «جستجو و برش»

سیستم مهندسی‌شده CRISPR-Cas9 که در ویرایش ژن استفاده می‌شود، از دو جزء کلیدی تشکیل شده است:

• پروتئین Cas9: یک آنزیم نوکلئاز که مانند «قیچی مولکولی» عمل کرده و DNA را برش می‌دهد.
• RNA راهنمای منفرد (sgRNA): یک مولکول RNA مصنوعی که به عنوان «GPS» عمل می‌کند و پروتئین Cas9 را به یک توالی DNA هدف خاص هدایت می‌کند.

فرآیند ویرایش در سه مرحله انجام می‌شود:

1. شناسایی (Recognition): sgRNA به یک توالی مکمل ۲۰ نوکلئوتیدی در DNA هدف متصل می‌شود. این اتصال برای اینکه پایدار باشد، نیازمند وجود یک توالی کوتاه و خاص به نام «موتیف مجاور پروتواسپیسر» (PAM) در نزدیکی محل هدف است.
2. برش (Cleavage): پس از اتصال sgRNA به DNA هدف، پروتئین Cas9 یک تغییر ساختاری پیدا کرده و یک شکست دورشته‌ای (DSB) در DNA ایجاد می‌کند.
3. ترمیم (Repair): ماشین‌آلات ترمیم DNA طبیعی سلول برای ترمیم این شکست فراخوانده می‌شوند.

۳.۳ پاسخ سلول: NHEJ در مقابل HDR

سلول از دو مسیر اصلی برای ترمیم شکست‌های دورشته‌ای DNA استفاده می‌کند که هر کدام پیامدهای متفاوتی برای ویرایش ژن دارند:

• اتصال انتهای غیرهمولوگ (NHEJ): این مسیر ترمیم، مکانیسم پیش‌فرض، سریع و مستعد خطای سلول است. NHEJ اغلب منجر به درج یا حذف‌های کوچک (indels) در محل برش می‌شود. این خطاها می‌توانند یک ژن را مختل کرده و آن را غیرفعال کنند.
• ترمیم با هدایت همولوژی (HDR): این مسیر، یک فرآیند ترمیم دقیق‌تر اما با فراوانی کمتر است که از یک الگوی DNA برای ترمیم دقیق شکست استفاده می‌کند. HDR می‌تواند برای درج یا تصحیح توالی‌های ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد.

در زمینه درمان HIV، استراتژی اصلی بر استفاده از مسیر NHEJ برای غیرفعال کردن ژن‌های حیاتی ویروس یا، با استفاده از دو RNA راهنما، برای بریدن و حذف کامل قطعه پروویروسی بین دو محل برش، متمرکز است.

بخش ۴: یک رویکرد «جراحی» برای درمان HIV: استراتژی‌های حذف پروویروس

۴.۱ استراتژی اصلی: «برش و حذف» پروویروس

مفهوم درمانی اصلی برای درمان HIV با استفاده از CRISPR، به کارگیری این سیستم به عنوان یک ابزار جراحی مولکولی برای بریدن و حذف فیزیکی DNA پروویروسی یکپارچه‌شده از ژنوم سلول میزبان است. این استراتژی بر طراحی sgRNAهایی متکی است که توالی‌های بسیار حفاظت‌شده در ژنوم HIV را هدف قرار می‌دهند تا در برابر سویه‌ها و زیرگروه‌های مختلف ویروس مؤثر باشند. اهداف کلیدی شامل تکرارهای بلند انتهایی (LTRs) در دو انتهای پروویروس و ژن‌های حیاتی مانند Gag، Pol و Rev هستند. هدف قرار دادن LTRها به ویژه جذاب است، زیرا ایجاد برش همزمان در LTRهای ‘۵ و ‘۳ می‌تواند منجر به حذف کامل پروویروس تقریباً ۹ کیلوبازی شود.

یک عنصر حیاتی در این استراتژی، استفاده همزمان از چندین sgRNA است که به آن «مالتی‌پلکسینگ» گفته می‌شود. از آنجایی که HIV دارای نرخ جهش بالایی است، استفاده از تنها یک sgRNA می‌تواند به سرعت با یک جهش در توالی هدف بی‌اثر شود. با این حال، استفاده از دو یا چند sgRNA که مناطق حفاظت‌شده مختلفی را هدف قرار می‌دهند، احتمال فرار ویروسی را به شدت کاهش می‌دهد. این رویکرد مالتی‌پلکس نه تنها می‌تواند تکثیر ویروس را به طور مؤثرتری مسدود کند، بلکه حتی پتانسیل ریشه‌کن کردن تمام DNAهای پروویروسی در کشت‌های سلولی را نیز نشان داده است.

۴.۲ استراتژی مکمل «قفل کردن در»: اصلاح گیرنده‌های کمکی میزبان

یک رویکرد جایگزین اما مرتبط، استفاده از CRISPR برای مقاوم‌سازی سلول‌ها در برابر عفونت HIV است. این استراتژی شامل هدف قرار دادن و غیرفعال کردن ژن‌های میزبان است که گیرنده‌های کمکی مورد استفاده HIV برای ورود به سلول را کد می‌کنند، به ویژه CCR5. این ایده از «بیمار برلینی» الهام گرفته شده است، فردی که پس از دریافت پیوند سلول‌های بنیادی از یک اهداکننده با جهش طبیعی (CCR5-Δ32) که گیرنده CCR5 را غیرفعال می‌کند، به طور عملکردی از HIV درمان شد. این رویکرد می‌تواند جمعیتی از سلول‌های ایمنی مقاوم به HIV را در بدن بیمار ایجاد کند.

انتخاب بین استراتژی «برش و حذف» (حذف پروویروس) و «قفل کردن در» (ناک‌اوت CCR5) صرفاً یک انتخاب فنی نیست؛ بلکه نشان‌دهنده تفاوت اساسی در فلسفه درمانی با پروفایل‌های خطر-سود متمایز است. استراتژی «برش و حذف» که ویروس را هدف قرار می‌دهد، از نظر تئوری یک درمان مستقیم و قطعی است که هدف آن از بین بردن منبع مشکل است. با این حال، این رویکرد نیازمند تحویل ماشین‌آلات CRISPR به تک‌تک سلول‌های آلوده نهفته در سراسر بدن است که یک چالش عظیم در زمینه تحویل محسوب می‌شود. علاوه بر این، این روش خطر اثرات خارج از هدف و جهش‌های ناخواسته در ژنوم میزبان در نزدیکی محل یکپارچگی ویروس را به همراه دارد. در مقابل، استراتژی «قفل کردن در» که میزبان را هدف قرار می‌دهد، یک درمان عملکردی است. این روش مخازن موجود را حذف نمی‌کند، بلکه هدف آن ایجاد یک سیستم ایمنی جدید و مقاوم است که بتواند ویروس را کنترل کند. این کار اغلب به صورت ex vivo بر روی سلول‌های بنیادی خونساز انجام می‌شود که فرآیندی کنترل‌شده‌تر است و به طور بالقوه خطرات اثرات خارج از هدف سیستمیک را کاهش می‌دهد. با این حال، ناک‌اوت کردن یک ژن میزبان مانند CCR5 می‌تواند پیامدهای ناشناخته بلندمدتی داشته باشد، مانند افزایش حساسیت به سایر عوامل بیماری‌زا مانند ویروس نیل غربی. بنابراین، انتخاب بین یک حمله مستقیم پرخطر/پرسود به خود ویروس و یک رویکرد غیرمستقیم و بالقوه ایمن‌تر که ژنوم خود میزبان را برای همیشه تغییر می‌دهد، مطرح است. آینده ممکن است در ترکیب هر دو رویکرد نهفته باشد: استفاده از ناک‌اوت CCR5 برای ساختن یک سیستم ایمنی مقاوم و به طور همزمان استفاده از حذف پروویروس برای کاهش مخزن موجود.

بخش ۵: از آزمایشگاه تا مدل‌های پیش‌بالینی: اعتبارسنجی فرضیه ریشه‌کنی

۵.۱ اثبات مفهوم In Vitro: حذف HIV در محیط آزمایشگاه

مطالعات بنیادین آزمایشگاهی، پایه و اساس این رویکرد درمانی را تشکیل می‌دهند. تحقیقات متعدد نشان داده‌اند که سیستم‌های CRISPR-Cas می‌توانند به طور کارآمد DNAی HIV را در رده‌های سلولی T انسانی آلوده به صورت نهفته، هدف قرار داده و برش دهند. یک مطالعه کلیدی از مرکز پزشکی دانشگاه آمستردام نشان داد که استفاده از دو gRNA علیه توالی‌های حفاظت‌شده HIV می‌تواند تمام ردپاهای ویروس را از سلول‌های T آلوده در کشت سلولی حذف کند. این مطالعات برای اثبات اینکه استراتژی مولکولی صحیح است و می‌تواند منجر به غیرفعال‌سازی کامل ویروس در سطح تک‌سلولی شود، حیاتی بودند.

۵.۲ اعتبارسنجی In Vivo: ریشه‌کن کردن HIV در مدل‌های حیوانی

گام بعدی و حیاتی، نشان دادن کارایی این روش در یک موجود زنده بود.

• مدل‌های موش انسانی‌شده: مطالعاتی با استفاده از موش‌هایی که با سلول‌های ایمنی انسانی پیوند زده شده بودند تا مدلی برای عفونت HIV ایجاد شود، انجام گرفت. محققان در دانشگاه تمپل و مرکز پزشکی دانشگاه نبراسکا نشان دادند که یک درمان متوالی – ابتدا سرکوب تکثیر ویروس با ART با رهش آهسته و طولانی‌اثر (LASER ART) و سپس تجویز CRISPR-Cas9 – منجر به حذف کامل DNAی HIV با قابلیت تکثیر در حدود یک‌سوم از حیوانات تحت درمان شد. این یک یافته برجسته بود که اولین اثبات مفهوم برای یک درمان قطعی در یک حیوان زنده را ارائه داد.
• مدل‌های پستانداران غیرانسانی: با پیشرفت تحقیقات، این روش در مدل‌های حیوانی پیچیده‌تر نیز آزمایش شد. مطالعه‌ای با استفاده از یک درمان جدید CRISPR (EBT-001) در ماکاک‌های رزوس آلوده به SIV (ویروس مرتبط با HIV) نشان داد که یک تزریق واحد می‌تواند به طور ایمن و کارآمد SIV را از ژنوم حیوانات حذف کند و به مخازن ویروسی در طیف وسیعی از بافت‌ها بدون اثرات خارج از هدف قابل تشخیص برسد. این کار یک پیشرفت قابل توجه بود و داده‌های ایمنی و کارایی لازم را برای کسب مجوز از FDA برای شروع آزمایش‌های بالینی انسانی فراهم کرد.

یافته مداوم مبنی بر اینکه ترکیب ART با CRISPR نتایج بهتری نسبت به هر یک از این درمان‌ها به تنهایی دارد، یک اصل اساسی را برای درمان عفونت‌های مزمن آشکار می‌کند: درمان باید دو مرحله‌ای باشد و همزمان به حالت‌های فعال و نهفته بیماری بپردازد. نقش ART سرکوب تکثیر فعال ویروس است. این کار از ایجاد سلول‌های آلوده جدید جلوگیری کرده و بار کلی ویروس را کاهش می‌دهد. نقش CRISPR حذف پروویروس یکپارچه‌شده از مخزن خاموش و نهفته است. مطالعات حیوانی نشان می‌دهند که استفاده از CRISPR به تنهایی کافی نیست، احتمالاً به این دلیل که تکثیر مداوم ویروس، مخازن جدیدی را سریع‌تر از آنچه CRISPR بتواند آنها را پاک کند، ایجاد می‌کند. استفاده از ART به تنهایی نیز کافی نیست، زیرا نمی‌تواند به مخزن نهفته دسترسی پیدا کند. هم‌افزایی این دو روش از آنجا ناشی می‌شود که ART «میدان نبرد» را از ویروس فعال پاک می‌کند و به «نیروهای ویژه» CRISPR اجازه می‌دهد تا به طور انحصاری بر روی دشمن نهفته و مستقر تمرکز کنند، بدون اینکه با تهدیدهای جدید غافلگیر شوند. این مدل «سرکوب و حذف» یک بینش استراتژیک قدرتمند است. این بدان معناست که هر درمان قطعی آینده برای HIV (و به طور بالقوه سایر ویروس‌های نهفته مانند هرپس یا هپاتیت B) به احتمال زیاد نیازمند یک مرحله اولیه سرکوب قوی و به دنبال آن یک مرحله ریشه‌کنی هدفمند خواهد بود. این مفهوم، ایده درمان را از یک «گلوله جادویی» واحد به یک کمپین استراتژیک و چند مرحله‌ای تغییر می‌دهد.

بخش ۶: گذر از مسیر دشوار ترجمه بالینی: چالش‌ها و راه‌حل‌های کلیدی

۶.۱ معمای تحویل: رسیدن به آخرین مخزن

شاید بزرگترین مانع برای درمان HIV مبتنی بر CRISPR، چالش تحویل باشد. مسئله فقط رساندن ماشین‌آلات CRISPR به برخی سلول‌ها نیست، بلکه رساندن آن به تمام سلول‌های آلوده نهفته است که در پناهگاه‌های آناتومیک در سراسر بدن، مانند مغز، بافت‌های لنفاوی، روده و مغز استخوان پراکنده هستند.

• ناقل‌های ویروسی (AAV): استفاده از ویروس مرتبط با آدنو (AAV) به عنوان یک ناقل اصلی تحویل مورد بررسی قرار گرفته است. AAVها در انتقال ژن به سلول‌ها مؤثر هستند و با موفقیت در مدل‌های حیوانی (به ویژه AAV9) و کارآزمایی بالینی EBT-101 استفاده شده‌اند. با این حال، آنها محدودیت‌های قابل توجهی دارند: ظرفیت بسته‌بندی کوچک (که قرار دادن Cas9 استاندارد و چندین gRNA را دشوار می‌کند)، احتمال وجود ایمنی از پیش موجود در انسان‌ها، و عدم توانایی در تجویز مجدد به دلیل پاسخ ایمنی قوی که ایجاد می‌کنند.
• ناقل‌های غیرویروسی (نانوذرات): ناقل‌های غیرویروسی مانند نانوذرات لیپیدی (LNPs) امیدبخش هستند. LNPs مزایایی مانند ظرفیت بسته‌بندی بزرگتر، ایمنی‌زایی کمتر و – مهم‌تر از همه – پتانسیل تجویز مجدد را ارائه می‌دهند. با این حال، کارایی آنها در هدف قرار دادن انواع سلول‌های خاص فراتر از کبد و جلوگیری از پاکسازی سریع از بدن، همچنان یک حوزه تحقیقاتی فعال است.

در جدول زیر، این دو سیستم تحویل مقایسه شده‌اند.

۶.۲ ضرورت دقت: ایمنی و اثرات خارج از هدف

ایمنی درمان CRISPR یک نگرانی اساسی است.

• جهش‌های خارج از هدف (Off-target): خطر اینکه سیستم CRISPR به طور ناخواسته مکان‌هایی در ژنوم انسان را که شبیه به توالی هدف هستند، برش دهد. چنین ویرایش‌های خارج از هدفی می‌توانند ژن‌های ضروری یا سرکوبگرهای تومور را مختل کرده و به طور بالقوه منجر به سرطان شوند. اگرچه بسیاری از مطالعات اثرات خارج از هدف کم یا غیرقابل تشخیصی را گزارش کرده‌اند، این امر به شدت به طراحی gRNA و حساسیت روش تشخیص مورد استفاده بستگی دارد.
• جهش‌های ناخواسته در محل هدف (On-target): یک خطر ظریف‌تر اما به همان اندازه مهم. حتی زمانی که CRISPR در مکان صحیح (پروویروس) برش ایجاد می‌کند، فرآیند ترمیم NHEJ مستعد خطا می‌تواند منجر به حذف‌های بزرگ ناخواسته یا بازآرایی‌های پیچیده در DNA میزبان در اطراف محل یکپارچگی شود. این می‌تواند انکوژن‌های مجاور را فعال کرده یا ژن‌های دیگر را مختل کند و یک نگرانی ایمنی جدی ایجاد کند.
• استراتژی‌های کاهش خطر: توسعه مداوم انواع Cas9 با وفاداری بالا، الگوریتم‌های محاسباتی بهبود یافته برای طراحی gRNA به منظور به حداقل رساندن تمایل به اثرات خارج از هدف، و روش‌های پیشرفته و بی‌طرفانه غربالگری برای ارزیابی جامع ایمنی هر درمان پیشنهادی، از جمله راهکارهای موجود برای مقابله با این خطرات هستند.

۶.۳ پیشی گرفتن از یک ویروس هزارچهره: چالش فرار ویروسی

مکانیسم دفاعی اصلی HIV نرخ جهش بالای آن است.

• مکانیسم فرار: فرآیند ترمیم NHEJ که برای غیرفعال کردن ویروس در نظر گرفته شده، گاهی اوقات می‌تواند ایندل‌های کوچکی در توالی هدف ایجاد کند که ویروس را غیرفعال نمی‌کنند، اما مانع از اتصال مجدد sgRNA می‌شوند. این امر یک ویروس جدید و با قابلیت تکثیر ایجاد می‌کند که اکنون به آن درمان خاص CRISPR مقاوم است.
• راه‌حل‌های استراتژیک: این موضوع مستقیماً به استراتژی مالتی‌پلکسینگ که در بخش ۴ مورد بحث قرار گرفت، مرتبط است. با هدف قرار دادن همزمان چندین منطقه بسیار حفاظت‌شده و از نظر عملکردی حیاتی ویروس (مانند محل اتصال پرایمر، LTR، Gag)، احتمال اینکه ویروس تمام مکان‌های هدف را به یکباره جهش دهد تا فرار کند، بسیار ناچیز می‌شود. این یک مسابقه تسلیحات تکاملی بین درمان و ویروس را برجسته می‌کند، جایی که طراحی درمانی باید مسیرهای تکاملی ویروس را پیش‌بینی کرده و از آنها پیشی بگیرد.

بخش ۷: افق پیش رو: کارآزمایی‌های بالینی، درمان‌های ترکیبی و مرزهای اخلاقی

۷.۱ اولین گام‌ها در انسان: کارآزمایی بالینی EBT-101

اولین کارآزمایی بالینی یک درمان مبتنی بر CRISPR برای HIV، با حمایت شرکت Excision BioTherapeutics، یک گام مهم رو به جلو است. این کارآزمایی از ناقل AAV9 برای تحویل SaCas9 و دو gRNA که LTRهای HIV را هدف قرار می‌دهند، استفاده می‌کند. یافته‌های اولیه بر ایمنی و تحمل‌پذیری دارو متمرکز بوده و نشان داده‌اند که در دوزهای اولیه، درمان ایمن به نظر می‌رسد. با این حال، بسیار مهم است که توجه داشته باشیم که در این دوزهای پایین، درمان به عنوان یک علاج قطعی عمل نکرده است و ادعاهای رسانه‌ای مبنی بر درمان قریب‌الوقوع، زودهنگام و گمراه‌کننده هستند. نتیجه کلیدی این است که کارآزمایی ایمنی اولیه را برقرار کرده و راه را برای آزمایش دوزهای بالاتر و بالقوه مؤثرتر هموار کرده است.

۷.۲ آینده در ترکیب است: استراتژی‌های درمانی هم‌افزا

درمان نهایی HIV به احتمال زیاد شامل یک حمله چندجانبه خواهد بود. آینده فراتر از CRISPR به عنوان یک تک‌درمانی است. پتانسیل ترکیب حذف پروویروسی با واسطه CRISPR با سایر روش‌های درمانی نوین، مانند عوامل معکوس‌کننده نهفتگی (استراتژی «شوک و کشتن») برای فعال‌سازی مجدد مخزن، یا آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده گسترده (bNAbs) و واکسن‌های درمانی برای تقویت توانایی سیستم ایمنی در پاکسازی سلول‌های آلوده، بسیار زیاد است. چنین رویکردهای ترکیبی می‌توانند به طور هم‌افزا برای غلبه بر چالش‌های پیچیده مخزن نهفته عمل کنند.

۷.۳ پیمایش در هزارتوی اخلاقی: ویرایش سوماتیک در مقابل ژرم‌لاین

ویرایش ژن مسائل اخلاقی عمیقی را مطرح می‌کند که باید با دقت مورد بررسی قرار گیرند.

• درمان سلول‌های سوماتیک (هدف): باید تأکید کرد که تمام تحقیقات فعلی برای درمان HIV بر روی ویرایش سلول‌های سوماتیک متمرکز است – یعنی اصلاح سلول‌های یک بیمار بدون تأثیر بر فرزندان او. این رویکرد به طور گسترده برای درمان بیماری‌های شدید، به شرطی که خطرات با مزایای بالقوه توجیه شوند، از نظر اخلاقی قابل قبول تلقی می‌شود.
• ویرایش ژرم‌لاین (خط قرمز): این در تضاد با ویرایش ژرم‌لاین (اصلاح تخمک، اسپرم یا جنین) است که منجر به تغییرات ارثی می‌شود که به نسل‌های بعد منتقل می‌شود. این کار در حال حاضر در اکثر کشورها غیرقانونی است و به دلیل نگرانی‌های عمیق ایمنی (اثرات ناشناخته بلندمدت) و مسائل اخلاقی مربوط به رضایت، اصلاح نژاد (eugenics) و پتانسیل ایجاد یک «شکاف ژنتیکی» در جامعه، توسط جامعه علمی به شدت محکوم شده است.
• دسترسی و عدالت: یک چالش حیاتی این است که اطمینان حاصل شود که اگر یک درمان مبتنی بر CRISPR توسعه یابد، برای میلیون‌ها نفر مبتلا به HIV در سراسر جهان قابل دسترس و مقرون به صرفه خواهد بود، نه فقط برای عده‌ای معدود. این امر سوالات مهمی را در مورد عدالت و برابری در سلامت جهانی مطرح می‌کند.